0. 活体生物发光成像 (BLI)的原理

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荧光素在ATP和氧气的作用下，发生氧化反应，产生CO2和氧化荧光素，并发出562nm的荧光。其辅因子是Mg2+，催化该反应的酶是荧光素单加氧酶Luciferin 4-monooxygenase

0.5 实验目的

以最常见的GL-261+c57的组合模型为例，利用小动物活体光学成像系统（如IVIS Spectrum），监测C57BL/6小鼠体内GL261-luc肿瘤的生长情况及生物发光强度。

1. 实验材料与试剂准备

1.1 核心试剂

  • 底物： D-Luciferin, Potassium Salt (D-荧光素钾盐)。
    • 配置方法： 用无菌DPBS溶解至 15 mg/mL。
    • 过滤： 使用0.22 µm滤膜过滤除菌。
    • 分装与保存： 避光分装（如1 mL/管，为方便可15ml一管），-20°C保存。切勿反复冻融。
  • 麻醉剂： 异氟烷 (Isoflurane)。
  • 脱毛膏/推毛剪： 针对C57黑鼠可有。
  • 眼膏： 红霉素眼膏或金霉素眼膏（防止麻醉期间角膜干燥，我们可不使用）。

1.2 仪器设备

  • 小动物活体光学成像系统 (IVIS Spectrum, Ami, 或类似设备)。
  • 气体麻醉机及氧气源。
  • 1 mL 注射器及 25G/26G 针头。
  • 电子天平。

2. 实验前准备

2.1 脱毛处理

C57小鼠的黑色毛发和皮肤中的黑色素会吸收大量光子。成像前24小时进行脱毛可避免成像当天皮肤炎症干扰信号。颅内模型需剃除头顶至颈部的毛发；皮下模型剔除肿瘤周围至少1cm范围内的毛发。可先用推毛剪推去长毛，再涂抹脱毛膏（停留时间1-2分钟内，防止灼伤皮肤），温水擦拭干净。

2.2 仪器预热

  • 打开成像系统软件，初始化仪器。
  • CCD制冷： 确保CCD相机冷却至工作温度（通常为 -90°C），需等待约15-20分钟至Status变绿。

3. 实验操作步骤

3.1 称重与底物注射

  1. 称量小鼠体重（不称就估计20 g）。
  2. 底物剂量计算： 标准剂量为 150 mg/kg。
    • 简便算法： 使用浓度为 15 mg/mL 的母液，按 10 µL/g 体重注射。
    • 举例： 20 g 小鼠腹腔注射 200 µL 底物。
  3. 注射方式： 腹腔注射。注射后轻轻按摩腹部以助扩散。
  4. 计时开始： 注射底物的时间点记为 T=0。

3.2 动力学等待期

  • 荧光素酶反应不是瞬间达到峰值的。腹腔注射后，底物需要时间被吸收、进入血液、穿透血脑屏障并进入细胞。 注射后，将小鼠放回笼中自由活动 10分钟。
  • 注意： 多数GL261-luc模型的信号峰值出现在注射后 10-20分钟。如果为了获得极高精度的量化数据，建议第一次实验时对一只小鼠进行连续成像（每2分钟一次）以测定最佳峰值时间。常规实验通常统一在注射后7分钟。

3.3 麻醉诱导

  1. T=7 min：将小鼠放入麻醉诱导盒。
  2. 开启异氟烷：浓度 **3-4%**，氧气流速 1-2 L/min。
  3. 待小鼠翻正反射消失（约1-2分钟），涂抹眼膏保护角膜。

3.4 上机成像

  1. 转移小鼠： 将小鼠转移至成像舱内的温控载物台（37°C）。
  2. 维持麻醉： 将小鼠鼻子对准麻醉面罩，异氟烷浓度调至 1.5-2% 维持。
  3. 摆位：俯卧位 (Prone)。确保头部水平，不要歪斜。
  4. 参数设置：
    • Imaging Mode: 生物发光或化学发光。
    • Exposure Time: 建议选 **Auto (自动)**。早期肿瘤信号弱，可能需要60s；晚期肿瘤信号强，1s都可能过曝。Auto模式能防止信号饱和。
    • Binning: 早期/微小转移：Medium (8) 或 High (16)， 灵敏度高，分辨率低。晚期大肿瘤Small (4) 或 Medium (8)。
    • F/Stop (光圈): 1 ，光圈最大，进光量最多。
    • Field of View (FOV): 根据小鼠数量选择，通常3-5只/次。
  5. 采集图像。

3.5 图像检查

  • 检查图像是否有饱和点：软件通常以红色或紫色高亮显示饱和区域。如果出现饱和，必须缩短曝光时间重拍，否则数据无效。
  • 检查是否在信号峰值期：如果是第一次做该细胞系，建议间隔5分钟再拍一张，确认信号没有剧烈衰减。

3.6 实验结束

  1. 关闭麻醉气体，取出小鼠。
  2. 将小鼠置于复苏区，待其完全苏醒、走动正常后放回笼盒。用70%酒精擦拭成像舱内部及麻醉面罩。

4. 数据分析

使用配套软件进行分析：

  1. 单位选择：不要使用 Counts (原始计数)。使用 Radiance (p/sec/cm²/sr) 或 Total Flux (photons/sec)。 Radiance 归一化了曝光时间、Binning和光圈大小，使得不同日期的实验数据可以互相比较。
  2. 圈选感兴趣区 (ROI)： 使用 Circle 或 Contour 工具圈出头部肿瘤区域。保持ROI大小在不同小鼠间相对一致，或覆盖所有信号区域。在小鼠身体无信号部位圈一个相同大小的ROI作为本底，通常软件会自动扣除。
  3. 数据导出： 导出 Total Flux (p/s) 数据至 Excel 进行统计作图。

5. 常见问题

问题现象 可能原因 解决方案
信号极其微弱 1. 黑色素遮挡
2. 肿瘤太小/细胞丢失质粒
3. 颅骨遮挡		 1. 确保脱毛彻底。C57皮肤本身也有色素，信号永远比裸鼠弱，这是正常的。
2. 重新检测细胞的Luc活性。
3. 增加Binning值 (至8或16)。
信号弥散/全身都有 1. 底物腹腔注射误入肠道/皮下
2. 肿瘤发生脊髓或全身转移		 1. 注射需准确，回抽无空气/液体再推药。
2. 检查尾部静脉或脊柱信号。
背景噪音过高 1. 饲料含荧光物质
2. 笼盒污染		 1. 换饲料。
2. 清洁成像舱，用黑布遮盖成像仪防止漏光。
不同天数数据波动大 注射到底物起效的等待时间不一致 每次都在注射后T=7 min麻醉，T=12-15 min成像，绝不随意更改时间窗。
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