guideline：细胞冻存

实验原理

细胞传代通过酶解和机械吹打使贴壁细胞脱离培养表面，按比例接种至新容器，解决接触抑制问题。

以GL261为例：

类别	物品
仪器	生物安全柜、CO₂培养箱、离心机、倒置显微镜、血球计数板/细胞计数仪
耗材	T25培养瓶、15 mL离心管、移液器、枪头
试剂	• PBS缓冲液 • 0.25%胰酶 • 完全培养基（DMEM+10%FBS+1%双抗）

细胞准备（至对数生长期）：对于T25，取生长至 80%融合度的GL261细胞（传代后约48小时），吸弃旧培养基，PBS轻柔冲洗2次去血清抑制物，加入1 mL 0.25%胰酶，37℃消化 1.5分钟，镜下观察细胞变圆后加2 mL完全培养基终止消化，用培养基冲洗培养基、吹打均匀后转移至15 mL离心管。
300×g离心5分钟，弃上清。
配置冻存液：90% FBS + 10% DMSO现配现用或用商品化冻存液。离心后的细胞沉淀用1 mL冻存液重悬，轻柔吹打、避免气泡。
细胞密度一般为10^6到7/mL
分装至冻存管（1 mL/管），拧紧管盖，标记细胞系、日期、代数、操作者信息，放入程序降温盒至-80℃冰箱24h后放液氮或直接放-80℃冰箱。