琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验室中最基础、最核心的技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA和RNA片段。无论是PCR产物验证、酶切分析还是质粒提取，都离不开它。本文将深入浅出地为您解析其原理，并一步步指导您完成实验，同时分享关键的注意事项和技巧。

实验原理

分子筛效应

琼脂糖是从红藻中提取的一种线性聚合物。在加热溶解再冷却后，它会形成具有网状结构的凝胶。这个网孔就像一个大筛子：小分子DNA可以轻松穿过网孔，跑得快；大分子DNA则阻力大，跑得慢。因此，在一定的电场作用下，DNA分子就会根据其大小被分离开来。

为什么RNA不行？

RNA分子通常是单链的，容易形成二级结构（如发夹、茎环），这使得不同RNA分子的形状和大小不再严格相关，无法通过琼脂糖凝胶准确判断其分子量。更重要的是，环境中无处不在的RNase 极易降解RNA，导致条带模糊。分析RNA通常使用变性琼脂糖凝胶电泳（如加入甲醛），以消除二级结构的影响。

RNA用什么？

对于精确的RNA分析，更常用的方法是Northern Blot，WB或直接使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

蛋白质可以吗？

不可以。蛋白质的电荷、大小和形状各异，琼脂糖凝胶的网孔不足以有效分离。蛋白质的电泳通常在聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） 中进行，并常加入SDS（十二烷基硫酸钠） 来使蛋白质带均匀的负电荷，从而仅根据分子量大小进行分离，这就是SDS-PAGE。

电泳原理：负电向阳极移动

DNA和RNA的骨架含有磷酸基团，使其在中性pH环境下带负电荷。因此，当将它们置于电场中时，会从负极向正极移动。

染料的选择（参考链接）

我们需要染料来让看不见的核酸“显形”。

EB（溴化乙锭)

是高度灵敏的嵌入性芳香族荧光化合物，为强致癌诱变剂，但价格便宜，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸。通常用于分子遗传学、DNA和染色质结构分析等研究中，特别是国内很多实验室仍在使用EB进行凝胶核酸电泳实验的染色。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性，在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。EB的这种特性使其成为一种核酸染料，常用于琼脂糖凝胶电泳中的核酸染色。溴化乙锭在紫外区302nm和366nm处有吸收峰，在紫外光的照射下，溴化乙锭可被激发出橙红色的荧光（590nm）。结合有DNA的溴化乙锭复合物的荧光强度要比没有结合DNA的染料高出20-30倍，因此溴化乙锭可检测到少至10ng的DNA条带，非常灵敏。

原理：EB是极易渗透细胞膜与胞内DNA嵌合的小分子，它具有平面共轭大环结构，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，是典型的DNA分子插入试剂，菲啶环插入到DNA分子的碱基对之间，与DNA嵌合形成稳定的复合物，并影响DNA的复制，破坏正常的遗传生理现象。在紫外线激发下， 未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色荧光。在与DNA或双链 RNA结合时，荧光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。在核酸分子中， EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。在凝胶中加入终浓度为 0.5 μg/ml 的 EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法适用于一般性的核酸检测。

注意：EB作为诱变性的化合物，它在人体中诱导突变的机制是不可逆转的，如果你只是手接触了用 EB污染的东西 , 用肥皂水洗一下就没事了。一定要带手套操作有 EB 污染的实验。EB有很强的诱变剂，可引起碱基错配诱发癌变，操作时一定要慎重。

GoldView I型/II型染料

GoldView(GV) 是一种可代替EB的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于RNA染色。

实质上，所谓的Goldview就是吖啶橙，也就是传说中的AO，

吖啶橙（ acridine orange， AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA 和 RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为 492nm，荧光发射峰为 530nm（DNA ）、640nm（RNA ），它与双链 DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm）激发下,细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质 RNA 发橘红色荧光（ >580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显DNA、RNA 两种核酸 。

有一种传统的细胞凋亡试验，采用的染料正是吖啶橙，也就是AO/EB染色试验，EB无法穿透完整的细胞膜，而AO可以穿过细胞膜染上细胞核，以此来区分凋亡和未凋亡的细胞。

缺点：Goldview对于大片段DNA的染色效果良好，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好，还有一个很致命的弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭，一般5-10min条带就会消失。另外Goldview不适用于胶回收。且荧光效果远不如EB，灵敏度差，本底色严重，不利用于回收，不稳定，在紫外灯下其诱导突变能力极高。

注意：GoldView是一种剧毒产品，实验是一定要带好防护手套。

GelRed和GelGreen

GelRed和 GelGreen的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。不过也正是因为如此，其价格大约是GoldView的十倍左右。该染料是目前市场中最灵敏的凝胶核酸染料之一；稳定性极好，可以使用微波炉加热，可以在室温下保存。适用于预制凝胶和凝胶电泳后染色；染色过程简单，与EB一样，在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解，而电泳后染色过程也只需30分钟且无需脱色或冲洗；对 DNA 和 RNA 的迁移影响小，对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I；与标准凝胶成像系统以及可见光激发的凝胶观察装置完美兼容，使用 312nm 激发的 UV 凝胶成像系统时，GelRed 可以完美的替代EB，使用 254nm 激发的 UV 凝胶成像系统或可见光激发的凝胶观察装置时，GelGreen 足以替代任意一种 SYB染料。但该染料会使小片段DNA迁移慢一些（与EB相比)。

SYBR Green 和SYBR Gold

SYBR 系列荧光染料是一种高灵敏的核酸染料， 其化学本质是一种非对称性花菁类化合物， 与核酸具有极高的亲和力，自推出后在国外实验室备受推崇并在近几年得到广泛的应用，以下对其性质 和应用进行简述 。YBR 系列主要包括 SYBR Green Ⅰ、SYBR Green Ⅱ、SYBR Gold 三种染料 。

SYBR 系列荧光染料稳定性差，也有毒性。它属于花箐素类核酸染料，花箐类染料不是无毒的，而只是低毒的，电泳级别的是经过修饰的，修饰有三种：1.加入卤素或氰基。2.插入环羟基。3.加入稳定剂。SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。SYBR Green和SYBR Gold相对于EB的稳定性要差很多。SYBR系列的染料也能进入细胞染色线粒体以及核内的DNA，从而产生危害。SYBR Green I已被证实在紫外光下将会产生强诱变能力，使DNA或其他物质发生突变。

SYBR Green I一般用来染双链DNA，它是嵌在DNA螺旋的小沟里面，价格便宜；SYBR GreenII一般用来染单链DNA和RNA，原理不清。

实践篇

1. 确定所需的凝胶百分比

凝胶浓度决定了网孔大小，直接影响分离范围。

琼脂糖浓度 (%) 最佳线性DNA分离范围 (bp)
0.5% 1,000 - 30,000
0.7% 800 - 12,000
1.0% 500 - 10,000
1.2% 400 - 7,000
1.5% 200 - 3,000
2.0% 50 - 2,000

技巧：对于标准PCR产物（100-1000 bp），1.5%-2% 的凝胶最为常用。三乙酰-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE） 或三硼酸-EDTA（TBE） 通常是首选的缓冲液，因为三酸溶液是微碱性条件下的有效缓冲液，可保持DNA去质子化并溶于水。EDTA是一种螯合剂，能使可能损害被分析的DNA的核酸酶失活。

2. 凝胶浇注

  1. 称量：根据上述所需浓度称取适量琼脂糖粉末，倒入锥形瓶。
  2. 溶解：加入适量1x TAE或TBE电泳缓冲液，轻轻摇匀。若尺寸为8cm×8cm，厚度为0.5cm，则体积为32ml。如果是5x5x1，则琼脂糖0.25g，加到盛有25ml电泳缓冲液。为防止后面加热蒸发损失，可以适量多加。

**注意：缓冲液不要超过锥形瓶容量的50%**，防止沸腾溢出。

  1. 加热：在微波炉中高火加热约1-2分钟，沸腾后取出摇动，重复两到三次，直至琼脂糖完全溶解，溶液变得清澈透明。

注意：防止过热沸腾溢出。加热后瓶口很烫，需戴防热手套拿取。

  1. 冷却：室温冷却至约50-60℃（手摸瓶壁感觉烫但能握住即可），以防烫坏制胶槽。
  2. 倒胶：将胶槽两端用胶带或挡板封好，插入梳子。将冷却的琼脂糖溶液缓缓倒入槽内，避免产生气泡。当然梳子后面插也可以。

技巧：若有气泡，可用移液器吸头或枪头轻轻戳破。

  1. 凝固：室温下静置约20-30分钟，待凝胶凝固。

3. 将样品/marker与加载染料混合

  1. 在PCR管或离心板中，将DNA样品与6x Loading Buffer（上样缓冲液） 按5:1的比例混合。

    上样缓冲液的作用：

    • 增重（含甘油或蔗糖）：使样品沉入加样孔底部，不会飘散在缓冲液中。
    • 追踪（含染料如溴酚蓝）：在电泳过程中实时显示电泳前沿的位置。
    • 显色：便于观察加样操作。

4. 凝胶装入

  1. 小心拔出梳子，动作应垂直向上，防止撕破加样孔。
  2. 将凝胶（连同胶托）放入电泳槽中，加样孔朝向阴极 黑色端。
  3. 向电泳槽中倒入1x TAE/TBE缓冲液，液面需刚好没过凝胶表面约1-2mm。

5. 凝胶运行

  1. 上样：用移液器吸取混合好的样品，缓慢、稳定地加入加样孔中。在其中一个孔中加入marker（DNA ladder）。marker最好是在样品行的两端各装一个。凝胶不一定总是在一条完美的直线上运行，所以在两端各装一个marker可以更容易确定存在的片段的大小。

注意：枪头不要戳破凝胶孔底部，也不要溢出到相邻的孔中。

  1. 通电：确保电极和盖子的方向正确！盖上电泳槽盖子，连接电极，设置合适的电压（通常5-10 V/cm，以两电极间的距离计算）。根据溴酚蓝的迁移位置，运行适当时间后停止。

注意：120V、35分钟是一个很好的近似值，但是这应该根据所使用的凝胶比例和预期分离的片段大小进行调整，以获得良好的电分离。电压过高会导致条带模糊（发热导致DNA变性）或“微笑条带”（中间跑得快）；电压过低则耗时过长。

注意：未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中，室温下染色20-25 分钟。

6. 可视化

戴上紫外线防护眼镜或面罩，将凝胶从电泳槽中取出，放入凝胶成像系统或紫外透射仪中拍照。若使用GelRed等安全染料，可在蓝光下观察，安全性更高。严禁裸眼直视紫外光源！ 以防紫外线损伤视网膜。

结果判读和分析

  1. 条带位置：通过与DNA marker条带的位置对比，估算未知DNA片段的大小。
  2. 条带亮度：条带的亮度大致反映了DNA的量。同一凝胶上，条带越亮，DNA浓度越高。
  3. 条带锐利度：单一、清晰、锐利的条带表明DNA样品纯度高、大小均一。若出现拖尾（smear），可能原因是DNA降解、蛋白污染或电压过高。

注意事项

  • 没有条带：DNA量不足、酶切/PCR失败、染料失效、忘记通电。
  • 条带模糊/拖尾：DNA降解、加样孔破裂、电压过高、凝胶融化。
  • 条带位置不对：凝胶浓度选择不当、分子量标准失效、缓冲液重复使用次数过多。
  1. 酶切时所加的DNA 溶液体积不能太大，否则DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。
  2. 酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1 小时完全降解1 mg λDNA 的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA 不象λDNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。市场销售的酶一般浓度很大，使用时可事先用酶反应缓冲液进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在10%以下，否则，酶活性将受影响。
  3. 观察DNA 离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA 分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA。
  4. EB 是强诱变剂，还有中等毒性，就是有致癌性。配制和使用时都要戴好手套。尽量不要把EB 洒到桌面或地面上。如果真的不幸洒到桌面或地面上了，凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
  5. 当EB 放太多了，胶染色过深，DNA 带看不清的时候，可将胶放入蒸馏水冲泡，30 分钟后再观察。

问题排查

  • 加样孔有荧光：有DNA 的滞留，其次多含蛋白质残留；蛋白质几乎不会被EB 染色，能出现荧光，则一定含有核酸。非常巨大的基因组DNA (>50kb)，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。
  • 酶残留：酶反应产物，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易在孔中出现荧光，其原因是酶与核酸几乎都有比较强的结合能力：基因组DNA 的PCR 产物电泳往往在孔中都有荧光，而且荧光强度与体系的特异性成反比。
  • 降解：即主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。
    • RNA的这种比较突出，降解的发生主要是在裂解液彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。
    • 以总RNA 抽提为例，总RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织。彻底裂解悬浮细胞的时间最短，彻底裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验室并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。
    • 若为基因组DNA 的抽提：假定消化使用的是含蛋白酶K的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞不应该降解，碾碎的组织不应该降解，大块组织：部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点，即使蛋白酶K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组DNA 在抽提过程中间不被降解。
    • 如何才能减少或者杜绝核酸降解呢？一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前，其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间，越快越好。
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