关于抗凝剂，再到EDTA-K₂ 的浓度和配置

实验室中常用的抗凝剂有肝素、乙二胺四乙酸盐（EDTA 盐）、枸橼酸盐、草酸盐等。

  • 肝素：是一种含硫酸基团的粘多糖，平均分子量为 15000 (2000~40000)，在肝肺肾等组织和肥大细胞、嗜碱性粒细胞的嗜碱性颗粒中。机制是增强抗凝血酶III（AT III）活性，从而间接抗凝。肝素对血液成分干扰较少，不影响红细胞体积，不引起溶血，常用 10.0~12.5 IU/mL 血液。
  • 枸橼酸盐：原理也是螯合钙离子。有2水喝5水等晶体。通常前者配成 109 mmol/L (32 g/L) 水溶液 ，与血液按 1:9 或 1:4 比例使用。6 mg 才能抗凝 1 mL血液。
  • 草酸盐：常用草酸钠、草酸钾和草酸铵，机制也是螯合钙离子，注意因使用浓度一般较高，会使细胞变形。
  • EDTA：乙二胺四乙酸盐，以二钾为例，是一种白色粉末，易溶于水。它的化学式为C10H14K2N2O8，分子量为404.6 g/mol，机制是螯合钙离子，全血细胞分析时，一般 1.5mg～2.2mg 可以抗凝 1ml 血液。对红细胞形态影响最小，钾盐较钠盐的溶解度大，全血细胞计数最好使用 EDTA 的钾盐。同时EDTA可以抑制核酸酶，故对于提核酸的实验，往往采用EDTA抗凝。

我们常使用EDTA，理论上：

image.png

各个参数：

终浓度目标 1.5× Ca²⁺ 总摩尔量
针筒死腔体积 1mL 注射器死腔 ≈ 0.05mL
润洗液残留量 润洗后针筒内残留液 ≈5μL
钙离子浓度 2.2–2.6 mmol/L（取2.4）

这样算出来，1ml血需要720mmol/L的浓度，但残留体积只需稍稍增大这个就会变化很多。具体可以按照理论公式，采用快速抽血以免凝血和溶血+固定体积抗凝剂或抗凝管直接加血的方式解决问题。

实验前，不用（快速抽血），或采用预配制，如源叶EDTA.2K抗凝剂100ml，取0.1ml可以抗凝1ml血，所以稀释10倍后润洗针管基本就够采血了，管子预先润洗或商品化抗凝管。

抗凝ep管的预处理

方法1：

  1. 标记：取 DNase-free EP 管，标记组别/编号；
  2. 加抗凝剂：每管预加 100μL源叶EDTA.2K抗凝剂；
  3. 干燥：开盖置于 37℃ 烘箱 10min，至完全干燥（无液滴残留）；
  4. 预冷：转移至冰盒备用（4℃）。

方法2：

  1. 标记：取 DNase-free EP 管，标记组别/编号；
  2. 加抗凝剂：每管使用源叶EDTA.2K抗凝剂冲洗，冲洗后回收；
  3. 预冷：转移至冰盒备用（4℃）。

小鼠终末采血

准备：

麻醉 异氟烷蒸发器（诱导 4%，维持 1.5%）
胰岛素针 29G（避免 >25G）
手术器械 解剖剪、镊子（酒精消毒）
操作板 泡沫操作板
  1. 同小鼠固定。让小鼠钻入放有异氟烷麻醉棉球的50ml离心管中，20s后检查麻醉深度，脚趾痛觉反射有无。
  2. 将小鼠四肢仰卧位用针头固定。
  3. 剑突下皮肤消毒，在剑突下1cm偏左与体壁成15°角进针，推进至感受到心尖搏动感。
  4. 缓慢回抽至血液流入针管，立即注入预冷的抗凝管或商品化抗凝管，轻柔颠倒混匀8次。
  5. 按照具体要求离心、提取血浆、PBMC或全血，样本在-80摄氏度冻存。
许可协议

本文采用 署名-非商业性使用-相同方式共享 4.0 国际 许可协议，转载请注明出处。

分享文章

评论