小鼠颅内成瘤模型（Intracranial Tumor Model）是神经肿瘤学研究中最重要、最经典的在体（in vivo） 实验模型之一。它能高度模拟人类脑瘤的生长环境，用于研究肿瘤发生发展、侵袭转移的机制，以及评估新型药物、基因治疗、免疫治疗等的疗效。

原理

1. 为什么选择颅内成瘤模型？

  • 模拟“免疫特权”环境：大脑具有血脑屏障（BBB）和相对豁免的免疫状态，颅内模型能最真实地反映药物穿透BBB的能力及肿瘤与独特脑微环境的相互作用。
  • 原位生长与侵袭：肿瘤细胞在真实的脑实质中生长，能更好地表现出其固有的侵袭性、血管生成特性及与神经元的相互作用，这是皮下荷瘤模型无法比拟的。
  • 临床相关性高：对于评估治疗脑胶质瘤、脑转移瘤的新方案，颅内模型是临床前研究的“金标准”，预测价值远高于异位模型。

2. 常用细胞系与模型类型

模型类型 常用细胞系 特点
胶质母细胞瘤 (GBM) U87, U251, GL261 (鼠源)， LN229, T98G GL261是免疫活性小鼠（如C57BL/6）的好选择，可模拟免疫应答；U87等常用于裸鼠
脑转移瘤 B16-F10 (黑色素瘤)， 4T1 (乳腺癌)， LLC (肺癌) 原发转移瘤难以建立，通常通过颅内原位注射模拟细胞定植大脑后的生长
髓母细胞瘤 DAOY, D283 Med 多见于儿童，模型常用于研究发育通路（如Shh）异常
患者来源异种移植(PDX) 原代肿瘤细胞 是最好的，保留患者肿瘤的异质性和分子特征，预测性极强，但建立困难、成瘤率不稳定

3. 动物的选择

  • 免疫缺陷鼠：如NOD/SCID, BALB/c Nude（无胸腺，T细胞缺失）。用于接种人源肿瘤细胞系，避免免疫系统排斥。主要是贵，不然我们都用了。
  • 免疫活性鼠：如C57BL/6, BALB/c。用于接种鼠源肿瘤细胞系如GL261。
  • 年龄与体重：通常选择6-8周龄的小鼠，体重约18-22g。小鼠太年轻颅骨太软，太老年则对手术耐受性差。

实验前准备

1. 细胞准备

  • 状态：使用处于对数生长期、活力 >95% 的细胞。传代后生长24-48小时为佳。
  • 消化：用胰酶消化后，必须用含血清的培养基彻底中和，并离心去除残余胰酶，防止其对脑组织的损伤。
  • 重悬与计数：用无血清的PBS或DMEM重悬细胞，使用台盼蓝染色进行精确细胞计数。当然，我们在实际成瘤过程中可以不重悬细胞，直接抽取细胞沉淀，容易堵针的同时能达到最大的细胞浓度。此时细胞计数也不再重要了
  • 浓度调整：根据预实验和文献，将细胞浓度调整至所需密度（如GL261常为1×10⁵ cells/µL in 5 µL）。细胞悬液需置于冰上保存，以减少细胞聚集和死亡，并在2小时内用完。

2. 动物准备

  • acclimation：小鼠购入后，在动物房至少适应3-5天。
  • 术前禁食：手术前4-6小时禁食，不禁水，以减少麻醉期间发生意外的风险。

3. 仪器与试剂准备

  • 立体定位仪 (Stereotaxic Frame)
  • 微量注射泵 (Microsyringe Pump)
  • Hamilton微量注射器：常用规格为10 µL。注意使用前必须用75%乙醇和无菌PBS彻底清洗。
  • 钻头与手术器械：高速颅骨钻头（0.5-0.9 mm），眼科剪、眼科镊、手术刀柄、缝针等，全部需高温高压灭菌。
  • 麻醉：常用异氟烷吸入麻醉（诱导3-4%，维持1.5-2%），配合氧气。其优点是苏醒快、深度易控。也可使用氯胺酮/甲苯噻嗪/戊巴比妥钠腹腔注射方案，按照各自的工作浓度搭配。
  • 镇痛与抗生素：术前可皮下注射卡洛芬（Carprofen, 5 mg/kg） 用于术后镇痛。术后可在伤口周围涂抹抗生素软膏（如金霉素眼膏）。

手术操作

1. 麻醉与固定

  1. 小鼠诱导麻醉后，将其门齿固定于门齿夹上，并将耳杆平稳地插入小鼠外耳道。注意：插入耳杆时动作要轻柔，过度用力会导致鼓膜破裂甚至颅底出血，这使得实验变量增加或动物死亡，也不符合动物伦理。成功的固定应达到“鼻对正中，头部不动，提尾不掉”的标准。同时要避免过度紧固，以防压迫小鼠迷走神经导致术中呼吸困难。
  2. 调整小鼠头部位置，确保颅骨表面处于水平状态（前囟Bregma和后囟Lambda在同一水平高度）。

2. 备皮与暴露颅骨

  1. 用小动物推剪剃掉穿刺点周围的皮肤，用75%酒精消毒小鼠头顶部皮肤。
  2. 用眼科剪沿失状缝纵向切开皮肤约1 cm，用棉签轻轻剥离骨膜，充分暴露前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。可用3% H₂O₂溶液轻轻擦拭颅骨，使骨缝清晰可见。

3. 定位与钻孔

  1. 根据实验设计，使用立体定位仪坐标系统确定注射靶点。常用靶点：

    • **右尾状核 (Right Striatum)**：前囟前0.5 mm，失状缝右侧2.0 mm，硬脑膜下3.0 mm。
    • **皮层 (Cortex)**：可根据需要选择。

  2. 颅骨钻在目标坐标处小心钻开颅骨。仅钻透颅骨，切勿损伤下方的硬脑膜，可能会硬脑膜出血导致小鼠术后2天急性死亡。

4. 注射细胞悬液

  1. 将装有细胞悬液的Hamilton注射器固定到注射泵上，将针头沿骨孔缓慢垂直下降至目标深度。
  2. 等待1分钟， 重要！ 让脑组织恢复，防止拔针时细胞被反吸。
  3. 设置注射参数（常用的参数：5 µL，注射速度1 µL/min）。缓慢的注射速度是防止细胞悬液沿针道返流和减少组织损伤的关键，如果出现反流，应该减慢注射速度。
  4. 注射完成后，再等待2分钟，至关重要！ 让细胞悬液充分扩散到组织中。
  5. 以1 mm/min退针。

5. 缝合与术后护理

  1. 用骨蜡封闭颅骨钻孔，防止出血和感染。
  2. 用5-0或6-0的可吸收缝线缝合皮肤。
  3. 将小鼠置于37℃加热垫上恢复，直至完全苏醒。单独饲养24小时，防止同伴舔舐伤口。
  4. 术后连续3天给予镇痛和监测体重。

监测方法

1. 监测方法

  • 临床评分系统：

    • 0分：正常，无任何症状。
    • 1分：轻度嗜睡，或一侧体毛轻微蓬松。
    • 2分：行动迟缓，偏向转圈（追尾）。
    • 3分：单侧肢体瘫痪，或持续转圈。
    • 4分：濒死状态，昏迷，或抽搐。
    • 终点标准：通常达到3分或体重下降超过20%时，需对人道处死小鼠。

  • **活体成像 (BLI)**：若细胞已用Luciferase标记，可通过活体成像仪定期监测肿瘤生长。

  • 小动物MRI：可精确测量肿瘤体积，但我们约不到也没这个条件。

2. 终点与样本收集

  • 到达终点后，采用CO₂窒息或过量麻醉等处死小鼠。

  • 收集脑组织：参加小鼠取脑固定环节。小心完整地取出大脑。

    • 用于冰冻切片：放入OCT包埋剂，于干冰/异戊烷中快速冷冻，存于-80°C。
    • 用于石蜡切片 (IHC)：放入4%多聚甲醛中固定24-48小时，然后进行脱水、石蜡包埋。
    • 用于蛋白/核酸提取：快速分离肿瘤组织，液氮速冻后存于-80°C。

常见问题

  • 不成瘤：细胞活力差、注射数量不足、免疫排斥、细胞悬液注射到脑室。
  • 动物术后死亡：麻醉过量、颅底出血、感染、肿瘤生长过快。
  • 实验重复性差：细胞状态不稳定、立体定位不准、注射速度不一致。
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