实验原理

细胞传代通过酶解和机械吹打使贴壁细胞脱离培养表面，按比例接种至新容器，解决接触抑制问题。

  • 胰酶作用：切割细胞表面蛋白（如钙黏蛋白），破坏细胞间连接。
  • EDTA辅助：螯合Ca²⁺/Mg²⁺，增强胰酶活性。
  • 传代比例：依据细胞增殖速度，维持对数生长期。

仪器和试剂

以GL261为例：

类别 物品
仪器 生物安全柜、CO₂培养箱、离心机、倒置显微镜、血球计数板/细胞计数仪
耗材 T25培养瓶、15 mL离心管、移液器、枪头
试剂 • PBS缓冲液
• 0.25%胰酶
• 完全培养基（DMEM+10%FBS+1%双抗）

实验步骤

  1. 37℃水浴预热试剂：完全培养基、胰酶、PBS约15分钟，生物安全柜紫外消毒30分钟，喷洒75%乙醇擦拭台面。
  2. 取出T25培养瓶，倒置显微镜下观察。融合度为80–90%（细胞铺满瓶底，轻微重叠），GL261呈梭形/多角形，伪足明显，无变圆、脱落、空泡化。
  3. 吸弃旧培养基。加入5 mL预温PBS，轻摇润洗细胞表面后吸弃以去血清抑制物。重复两遍。
  4. 加入1 mL 0.25%胰酶（覆盖瓶底），37℃孵育 1.5–2分钟。显微镜下观察细胞间隙增大、变圆，大部分细胞悬浮即加入2 mL完全培养基终止消化。吹打瓶壁约10次，转移悬液至15 mL离心管。
  5. 300×g离心5分钟，弃上清。
  6. 沉淀用1 mL完全培养基重悬，轻柔吹打至单细胞悬液。
  7. （可选）血球计数板或Countess II细胞计数，调整浓度至 2–3×10⁵ cells/mL。
  8. 新T25瓶中加入4 mL完全培养基。按传代比例加入细胞悬液。十字摇匀，37℃/5% CO₂培养。
  9. 24小时后观察贴壁情况，均匀分布为佳。

异常情况处理

  1. 若培养过程中死细胞过多，可以通过勤换液（隔天或者每天换液），且用优质的澳胎血清改善。
  2. 若培养过程中细胞分泌物、细胞碎片过多；可以将细胞消化下来，终止消化后用PBS洗涤细胞团，重悬后将细胞悬液转移至1.5ml EP管中离心（300×g离心4min），离心结束尽可能的吸干净PBS，可重复此步骤两次，根据离心下来的细胞量接种至合适的培养容器中。
  3. 细胞复苏状态差：一方面需要在冻存时加大冻存密度，一方面要从小变大，如在复苏时先把细胞复苏至1-2个6孔，待细胞恢复状态后再转移至更大表面积的培养瓶中培养。
  4. GL261细胞有密度依赖，传代比例不宜过大。
许可协议

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